Цифровое пространственное профилирование

Уникальная система Digital Spatial Profiler (DSP) в комплексе с системами nCounter или SPRINT позволяет проводить количественный анализ экспрессии до 800 генов и белков на стекле в выбранном участке после проведения ИГХ.  Выбор области интереса можно проводить различным образом: геометрически – обвести область интереса кругом, фенотипически – выбрать только области, в которых связалась та или иная флуоресцентная метка или просто отметить единичные клетки.


  • Высокая мультиплексность – до 800 мишеней
  • Минимальное количество образца -  один срез для анализа РНК или белков
  • 4-ех цветная визуализация для определения морфологического контента
  • Возможен повторный анализ слайдов
  • Динамический диапазон -  6  log
  • Настраиваемая разрешающая способность – выбор участка интереса от 600 микрон до единичной клетки
  • Высокая пропускная способность – до 20 срезов в день

 

Детекция РНК и белков происходит с помощью УФ-чувствительных олиго-конъюгированных зондов/антител. Например, зонд для детекции РНК представляет собой комплементарную мишени последовательность нуклеотидов, конъюгированную с УФ-чувствительным уникальным олигонуклеотидом (индексом).

Протокол эксперимента включает в себя стадию гибридизации зондов с образцом на стекле. После гибридизации с помощью прибора для DSP индексы отщепляются с помощью направленного УФ-облучения по выбранным областям. На следующем этапе они гибридизуются с зондами NanoString, несущими уникальные молекулярные штрих-коды, и подсчитываются системами nCounter или SPRINT. Кроме того индексирующие олигонуклеотиды могут быть разработаны таким образом, что будут совместимы с последующим анализом с помощью секвенатора Nanostring Hyb & Seq™ или на платформе Illumina, при этом количество исследуемых генов возрастает до 1000.

Технология DSP позволяет проводить мультиплексную оценку экспрессии генов и белков как по FFPE-блокам, так и по секциям свежезамороженных тканей. Технология DSP открывает для исследователей возможность проводить пространственное профилирование РНК вместо целевых белков при отсутствии в продаже совместимых с FFPE-блоками антител. Одновременный количественный анализ экспрессии генов и белков делает метод уникальным как для науки, так и для клинической медицины.


 

Примеры применения технологии цифрового пространственного профилирования

Экспрессия генов при воспалении миндалин

Проведено пространственное профилирование по 16 мишеням, список генов приведен в таблице ниже; негативные пробы использовались для определения соотношения сигнал/шум и определения пределов обнаружения.

CD19

CD40

POLR2A

Neg. Probe 1

CD274

CD74

PTPRC

Neg. Probe 2

CD3E

CD79A

RPS6

Neg. Probe 3

CD4

PDCD1

TNFSF9

Neg. Probe 4

Принцип выбора областей интереса: исследовали экспрессию генов в герминальных центрах (предварительная окраска по маркеру CD20+), т.е. областях пролиферации В-лимфоцитов,  и областях скоплений Т-лимфоцитов (окраска по маркеру CD3+). В работе были использованы 5 мкм-срезы FFPE-блоков и 10 мкм-секции свежезамороженной ткани. На рисунке представлены «тепловые карты» экспрессии исследуемых генов.

Немелкоклеточный рак легких: дифференциальная экспрессия генов в клетках опухоли и микроокружении

Проведено пространственное профилирование по 48 мишеням, список генов приведен в таблице ниже; выбор генов отражает необходимость изучения взаимодействия между опухолью, ее микроокружением и иммунной системой.

ACTB

CD40

CXCL10

IFNA2

SNRPD3

Neg. Probe 1

CCL11

CD45

CXCL11

IL1B

TGFB1

Neg. Probe 2

CCL2

CD68

CXCL5

IL6

TGFB2

Neg. Probe 3

CCL7

CD74

CXCL8

PD1

TGFB3

Neg. Probe 4

CD19

CD79A

CXCL9

PDL1

TIGIT

Neg. Probe 5

CD20

CD8B

FAU

PFN1

TUBB

Neg. Probe 6

CD3E

CX3CL1

GZMB

POLR2A

UBC

Neg. Probe 7

CD4

CXCL1/2

IDO1

PSMB2

VEGFA

Neg. Probe 8

Для выбора областей интереса образцы предварительно окрашивали антителами против CD45 (маркер иммунных клеток), чтобы идентифицировать микроокружение опухоли, и на опухолевый маркер панцитокератин (panCK), чтобы выделить клетки опухоли. На рисунке представлены «тепловые карты», демонстрирующие различия экспрессии генов в клетках опухоли и ее микроокружения.