Полимеразная цепная реакция. Оборудование ПЦР

Оборудование 

Компания Биовитрум выполняет поставки оборудования для оснащения лабораторий молекулярной генетики. Наше оборудование позволяет выполнять различные молекулярно-генетические исследования с использованием метода полиразной цепной реакции.

Основными направлениями деятельности лабораторий является диагностика инфекционных заболеваний и генная предрасположенность к различным заболеваниям.

Преимущества:

  • Универсальность. ПЦР-метод позволяет выявить возбудители нескольких заболеваний в одном образце материала.
  • Точность лабораторного исследования. В сравнении с другими методами, этот обладает  самой высокой чувствительностью.
  • При помощи ПЦР-метода можно обнаружить участок генома, который соответствует конкретному возбудителю заболевания.
  • Скорость лабораторного исследования. Метод позволяет получить результат в за 7-8 часов.

ПЦР – полимеразная цепная реакция. В 1983 году ее изобрел американский биохимик Кэри Муллис. ПЦР перевернула представление о диагностике заболеваний, а сам Муллис спустя десять лет получил за свое изобретение Нобелевскую премию. На сегодняшний день ПЦР-диагностика является самым достоверным методом при анализе инфекционных заболеваний. Суть полимеразной цепной реакции состоит в увеличении малых фрагментов ДНК в биологическом образце.

Изобретение ПЦР стало следствием развития анализа ДНК. Примерно к середине XX века ученые поняли значимость ДНК в любых живых организмах и научились выделять ее из образцов. Однако полученных объемов ДНК было явно недостаточно для проведения качественных исследований. Метод ПЦР позволяет значительно увеличить количество молекул ДНК в искусственных условиях с помощью ферментов. При этом происходит многократное удвоение только тех участков ДНК, которые необходимы для анализа и присутствуют в исходном образце. Новые фрагменты ДНК в ходе ПЦР не образуются и не снижают достоверность результатов.

Подобный процесс увеличения числа молекул ДНК называется амплификацией и является самым востребованным при проведении ПЦР-диагностики. Кроме того, в ходе ПЦР можно проводить и другие манипуляции с образцами – например, сращивать разные фрагменты ДНК или вводить мутации. Медицинские лаборатории занимаются, как правило, диагностикой заболеваний и установлением отцовства. Ученым-биологам больше интересны манипуляции с образованием новых молекул ДНК.

Ход реакции

Для получения достаточного для анализа количества молекул ДНК необходимо провести около 30 циклов, каждый из которых проводится в три этапа. Но если не соблюдать правила подготовки образцов, реакция не будет успешной. По статистике, до 70% ошибок в диагностике связаны именно с подготовкой и транспортировкой материала в лабораторию ДНК. Для забора крови рекомендуется использовать вакуумные системы. Во-первых, они безопасны для пациентов. Во-вторых, материал не будет контактировать с окружающей средой и не загрязнится. Что касается трех этапов реакции, то они следующие:

  • Денатурация. На этом этапе происходит разрушения водородных связей в молекуле. Двухцепочечную ДНК-матрицу в течение 0,5-2 минут нагревают до температуры 96°C (в других случаях – до 98°C). Для полной денатурации матрицы и праймеров иногда проводят предварительный прогрев смеси в течение 3-5 минут.
  • Отжиг. После того, как цепочки разойдутся, температуру нагрева понижают. В этот момент праймеры связываются с отдельными цепочками ДНК. Время этого этапа также составляет 0,5-2 минуты. Температура отжига зависит от типа праймера и обычно выбирается на 4-5°C ниже их температуры плавления.
  • Элонгация. На заключительном этапе происходит обратный процесс: ДНК-полимераза удваивает матричную сеть с помощью праймера. Время и температура элонгации зависят от полимеразы; наиболее подходящие условия получаются при температуре 72°C. Кроме того, на время элонгации влияет длина фрагмента, который нужно увеличить. Считается, что на каждую тысячу пар оснований должна быть отведена одна минута времени.
  • Финальная элонгация. Проводится только по завершению последнего цикла ПЦР с целью достройки всех одноцепочных фрагментов молекулы. Ее продолжительность составляет 10-15 минут.

 

Лаборатория использует следующие компоненты для проведения стандартной ПЦР:
ДНК-матрица: образец ткани, содержащий тот участок ДНК, который необходимо амплифицировать (размножить);
Два праймера, сопоставимые концам фрагмента ДНК;
Термостабильная ДНК-полимераза и ионы магния, необходимые для ее работы;
Дезоксинуклеотидтрифосфаты A, G, C, T;
Буферный раствор.