Проточные цитофлуориметры и клеточные сортеры

Проточная цитометрия — метод исследования оптических свойств клеток в режиме индивидуального анализа при помощи прибора, который называется проточным цитофлуориметром. 

Особенности проточной цитометрии:

• система гидрофокуссировки прибора обеспечивает измерения тысяч клеток в потоке
• прибор обеспечивает фиксирование сигналов светорассеяния и флуоресценции.
• используется для выделения популяции клеток по свойствам и определения содержания свойств до проведения циметрии.

 

Прибор для проведения клинических исследований и измерения по большому количеству параметров и выделения популяций клеток, оснащен оптической системой с монохроматическими лазерными источниками света и детектирования сигнала.

Современный прибор позволяет измерять до 32 параметров практически со 100% сохранением жизнеспособности клеток.

Цитометрия – общее название для методов исследования клеток. Она применяется в биологии, медицине и других смежных областях. Принято разделять цитометрию на проточную и статическую. Второй способ более простой – его можно реализовать с помощью микроскопов с дополнительным оборудованием, - но и результаты его будут не такими точными, как у первого. В свою очередь, проточная цитометрия может быть реализована с помощью проточных цитомеров или сортеров.

Первые клеточные приборы появился в 60-х годах прошлого века. Довольно скоро простое оборудование было усовершенствовано, а современные приборы способны определять несколько десятков параметров клеток. Отличие сортеров от других приборов для анализа состоит в том, что они не только определяют параметры клеток, но и сортируют их по этим группам. В настоящее время используется для следующих целей:

• Разделение и сортировка стволовых клеток;
• Анализ ДНК;
• Сортировка сперматозоидов;
• Изучение вирусов и разработка вакцин от них;
• Измерение уровня некоторых веществ в клетках;
• Подсчет абсолютного числа клеток в образце;
• Диагностика ВИЧ и т.д.

 

Для проведения исследований методом проточной цитометрии должны выполняться следующие условия:

• В качестве материала берутся гомогенные суспензии изолированных клеток;
• Должна обеспечиваться большая выборка клеток и ядер для получения достоверных данных;
• Оптическая система сортера, включая источник света, должна иметь очень точные характеристики. В противном случае, это приведет к большим погрешностям в исследованиях.

 

В основе работы лежит явление флуоресценции. Сами по себе клетки не являются источниками излучения и только лишь отражают падающий на них свет. Но если обработать их реагентом и затем пропустить через источник света, они станут источниками вторичного излучения. Измеряя длины волн, можно сортировать клетки по разным параметрам и подсчитывать их количество. Если поставлена задача найти в образце только клетки одного типа, то в него добавляется соответствующий им реагент. Остальные клетки при этом не будут светиться в заданном диапазоне длин волн.

Конструктивно приборы могут отличаться друг от друга, однако принцип действия у них остается одинаковым. Суспензия клеток окрашивается реагентами и вводится в проточную вибрационную камеру. На выходе из камеры клетки попадают в буферный раствор и проходят через луч лазера. Ширина струи составляет не более 100 мкм. При попадании в луч клетки рассеивают его свет и сами испускают незначительное излучение. Далее происходит оценка следующих параметров:

• Переднее рассеивание света. Оцениваются характеристики излучения, падающего на плоскость, перпендикулярную лазерному лучу. Эти параметры не могут дать точную информацию о каком-либо конкретном параметре клетки, однако отказываться от него нельзя. К примеру, анализируя переднее рассеивание света можно достоверно отделить живые клетки от мертвых.
• Боковое рассеивание света. Позволяет определить разные типы клеток или разные свойства одного типа клеток, так как именно от этого зависит угол отклонения светового пучка от направления луча лазера.
• Флуоресценция. С помощью системы зеркал в клеточном сортере можно одновременно измерять два флуоресцентных сигнала – красную и зеленую длину волны. Получившийся цвет дает исследователям много информации о клетках.
• Заряд клеток. В приточной вибрационной камере суспензия разбивается на капли. Разные клетки получают свой заряд и затем, при прохождении через электрическое поле, отклоняются в разных направлениях. Таким способом реализуется физическая сортировка клеточного материала.