Проточные цитофлуориметры и клеточные сортеры

Автоматический сортер клеток iSort™ (Thermo Fisher Scientific)

Сортер клеток iSort™ делает сортировку клеток по GFP-сигналу беспрецедентно быстрой и легкой. Компактный и простой в управлении сортер не требует прохождения длительного обучения настройке и калибровке, просто включите его, загрузите образец и следуйте несложным инструкциям на экране. Едва ли можно представить себе более быстрый, удобный и доступный инструмент для работы с GFP образцами.

    Проточная цитометрия — метод исследования оптических свойств клеток в режиме индивидуального анализа при помощи прибора, который называется проточным цитофлуориметром

    Особенности проточной цитометрии:

    • система гидрофокуссировки прибора обеспечивает измерения тысяч клеток в потоке
    • прибор обеспечивает фиксирование сигналов светорассеяния и флуоресценции.
    • используется для выделения популяции клеток по свойствам и определения содержания свойств до проведения циметрии.

    Схема работы проточного цитометра

     

    Прибор для проведения клинических исследований и измерения по большому количеству параметров и выделения популяций клеток, оснащен оптической системой с монохроматическими лазерными источниками света и детектирования сигнала.

    Современный прибор позволяет измерять до 32 параметров практически со 100% сохранением жизнеспособности клеток.

    Цитометрия – общее название для методов исследования клеток. Она применяется в биологии, медицине и других смежных областях. Принято разделять цитометрию на проточную и статическую. Второй способ более простой – его можно реализовать с помощью микроскопов с дополнительным оборудованием, - но и результаты его будут не такими точными, как у первого. В свою очередь, проточная цитометрия может быть реализована с помощью проточных цитомеров или сортеров.

    Первые клеточные приборы появился в 60-х годах прошлого века. Довольно скоро простое оборудование было усовершенствовано, а современные приборы способны определять несколько десятков параметров клеток. Отличие сортеров от других приборов для анализа состоит в том, что они не только определяют параметры клеток, но и сортируют их по этим группам. В настоящее время используется для следующих целей:

    • Разделение и сортировка стволовых клеток;
    • Анализ ДНК;
    • Сортировка сперматозоидов;
    • Изучение вирусов и разработка вакцин от них;
    • Измерение уровня некоторых веществ в клетках;
    • Подсчет абсолютного числа клеток в образце;
    • Диагностика ВИЧ и т.д.

     

    Для проведения исследований методом проточной цитометрии должны выполняться следующие условия:

    • В качестве материала берутся гомогенные суспензии изолированных клеток;
    • Должна обеспечиваться большая выборка клеток и ядер для получения достоверных данных;
    • Оптическая система сортера, включая источник света, должна иметь очень точные характеристики. В противном случае, это приведет к большим погрешностям в исследованиях.

     

    В основе работы лежит явление флуоресценции. Сами по себе клетки не являются источниками излучения и только лишь отражают падающий на них свет. Но если обработать их реагентом и затем пропустить через источник света, они станут источниками вторичного излучения. Измеряя длины волн, можно сортировать клетки по разным параметрам и подсчитывать их количество. Если поставлена задача найти в образце только клетки одного типа, то в него добавляется соответствующий им реагент. Остальные клетки при этом не будут светиться в заданном диапазоне длин волн.

    Конструктивно приборы могут отличаться друг от друга, однако принцип действия у них остается одинаковым. Суспензия клеток окрашивается реагентами и вводится в проточную вибрационную камеру. На выходе из камеры клетки попадают в буферный раствор и проходят через луч лазера. Ширина струи составляет не более 100 мкм. При попадании в луч клетки рассеивают его свет и сами испускают незначительное излучение. Далее происходит оценка следующих параметров:

    • Переднее рассеивание света. Оцениваются характеристики излучения, падающего на плоскость, перпендикулярную лазерному лучу. Эти параметры не могут дать точную информацию о каком-либо конкретном параметре клетки, однако отказываться от него нельзя. К примеру, анализируя переднее рассеивание света можно достоверно отделить живые клетки от мертвых.
    • Боковое рассеивание света. Позволяет определить разные типы клеток или разные свойства одного типа клеток, так как именно от этого зависит угол отклонения светового пучка от направления луча лазера.
    • Флуоресценция. С помощью системы зеркал в клеточном сортере можно одновременно измерять два флуоресцентных сигнала – красную и зеленую длину волны. Получившийся цвет дает исследователям много информации о клетках.
    • Заряд клеток. В приточной вибрационной камере суспензия разбивается на капли. Разные клетки получают свой заряд и затем, при прохождении через электрическое поле, отклоняются в разных направлениях. Таким способом реализуется физическая сортировка клеточного материала.